Pengujian sampel (sample QC) selalu dibutuhkan saat mengerjakan preparasi library dalam tahap Next Generation Sequencing (NGS). Pengerjaan preparasi library kompleks dan melibatkan banyak langkah yang dilakukan, selain itu, mesin sequencer akan menghasilkan banyak data yang perlu dianalisa. Dengan melakukan sample QC, kita dapat memastikan bahwa sampel yang diproses dalam setiap tahap sudah sesuai, serta dapat menghindari data yang tidak diinginkan sehingga mempermudah dalam analisa hasil. Sample QC yang dilakukan meliputi data konsentrasi pada sampel, ukuran, molaritas, dan integritas di beberapa tahap dalam langkah pengerjaan, mulai dari sampel awal, produk antara, sampai produk akhir library.
Produk akhir library NGS yang mempunyai kualitas rendah seperti konsentrasi yang terlalu rendah atau terdapat adapter dimer dan PCR artefak, apabila dimasukkan ke dalam flow cell, hasil sequencing akan mengarah pada metrics yang rendah seperti mapping rates dan target coverage yang rendah, serta tingkat duplikasi yang tinggi. Selain itu, sebagai contoh saat yang diperlukan untuk melakukan QC pada produk akhir library NGS yaitu saat memerlukan kumpulan dari beberapa library untuk di-sequencing.
Untuk mendapatkan hasil yang baik dari setiap library, sampel perlu dikumpulkan menjadi satu pada jumlah equimolar sebelum dimasukkan ke mesin sequencer. Hal ini membutuhkan analisa yang tepat pada setiap distribusi ukuran dan konsentrasi library untuk menentukan molaritas. Kumpulan library dengan konsentrasi molaritas yang sama akan mengoptimalkan penggunaan flow cell, yang akan mengarah pada hasil sequencing yang baik. Oleh karena itu, sample QC perlu dilakukan dan direkomendasikan untuk mengetahui sampel yang diproses sesuai dengan tujuan dan aplikasinya.
Metode untuk QC sampel DNA dan RNA sampai ke produk akhir library dalam tahapan NGS biasanya dilakukan dengan menghitung konsentrasi menggunakan pewarna yang dibaca secara fluoresens, serta distribusi ukuran sampel menggunakan teknik elektroforesis, yang dapat dilakukan dengan menggunakan 2100 Bioanalyzer System dan TapeStation dari Agilent.
Agilent menawarkan solusi terbaru untuk memudahkan melakukan QC pada sampel dengan TapeStation System. TapeStation System menggunakan teknologi ScreenTape dan otomatisasi pemindahan sampel sehingga memberikan kemudahan dan kecepatan bagi para pengguna dalam QC sampel pada tahap NGS (Gambar 1). Teknologi ScreenTape Device menawarkan kemudahan dalam penggunaan, sensitivitas yang lebih tinggi, kecepatan, dan resolusi yang lebih baik dibanding elektroforesis konvensional. Dengan berkembangnya kebutuhan teknologi NGS selama pandemi COVID-19, mengakibatkan dibutuhkannya suatu solusi untuk mempermudah dan mempercepat pengujian sampel yang akan masuk dalam proses NGS. Dengan jumlah sampel yang banyak, TapeStation hanya membutuhkan waktu 90 menit untuk mendapatkan data QC dari 96 sampel, tanpa interupsi.
ScreenTape Device dapat langsung diletakkan di dalam alat TapeStation dan siap untuk digunakan setelah dilakukan preparasi sampel. Metode deteksi sampel pada TapeStation menggunakan fluoresens dye yang dicampurkan pada sampel. Kemudian, sampel akan ditransfer secara otomatis ke dalam ScreenTape Device. ScreenTape Device berisi gel dan buffer yang dapat memisahkan secara elektroforesis untuk 1 sampai 16 sampel secara individual sehingga menjamin tidak adanya kontaminasi antar sampel.
Sampel yang dibutuhkan hanya 1 sampai 2 µl dengan konsentrasi paling rendah yang dapat dideteksi yaitu 5 pg/µl. Hasil tersebut bergantung pada jenis DNA/RNA ScreenTape yang digunakan. Separasi secara elektroforesis dilakukan dalam waktu 1 sampai 2 menit per sampel. Penggunaan ScreenTape dapat disesuaikan dengan jumlah sampel yang ingin dikerjakan dan sisa well dari 16 well pada ScreenTape dapat disimpan untuk penggunaan selanjutnya sehingga dapat memudahkan perhitungan cost per sample.
TapeStation Analysis Software sangat intuitif dan mudah digunakan dalam menunjukkan data di berbagai format. Hasil format dapat dilihat dalam bentuk gambar gel dan elektroferogram dimana intensitas fluoresens diplot bersama dengan ukuran. Sebagai tambahan, data kalkulasi seperti ukuran, kuantitas, molaritas, dan nilai integritas dipresentasikan dalam bentuk tabel. Ukuran yang didapatkan merupakan hasil kalkukasi perbandingan dengan ladder yang digunakan dan software memampukan menghitung ukuran pasang basa dari jenis sampel pita tunggal atau smear (Gambar 2 dan Gambar 3).
Algoritma software untuk menganalisa integritas dari sampel genom DNA dan total RNA juga sudah diimplementasikan pada software TapeStation. DNA Integrity Number (DIN) dan RNA Integrity Number (RIN) memungkinkan pengguna untuk menentukan integritas level degradasi sampel secara objektif dan penilaian yang dapat direproduksi. Angka integritas berkisar dari angka 10 yang menunjukkan bahwa sampel DNA/RNA masih utuh (intact) sampai angka 1 yang menunjukkan bahwa DNA/RNA sudah sangat terdegradasi (rusak). Pengguna perlu menentukan dan memvalidasi batas angka integritas untuk setiap jenis sampel dan tahap pengerjaan untuk keberhasilan aplikasi berikutnya.
Gambar 1. A. 4200 TapeStation. B. ScreenTape Device
Gambar 2. A. Data Gambar Elektroferogram. B. Data Tabel.
Gambar 3. A. Data Gambar Gel. B. Data Gambar Elektroferogram.
